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本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，粗提物通过独特的内毒素清除剂选择性结合离心除去内毒素，然后离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

• 离心吸附柱内硅基质膜全部采用特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
  
• 不需要使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。快速，方便，从150～300mL大肠杆菌LB((Luria-Bertani)培养液中，可快速提取0.5～2mg纯净的高拷贝质粒DNA，提取率达80～90%。
  
• 独特工艺配方清除内毒素，内毒素含量极低（＜0.1 EU/μg DNA），细胞转染效果极佳。也可直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序、等各种分子生物学实验。

• 内毒素清除剂常温运输，4℃可以保存一年，长期保存放-20℃。
  
• RNase A保存在即用型甘油缓冲液中，常温运输，收到后，不超过25℃室温至少保存6个月，4℃保存12个月，长期保存放-20℃。
  
• 第一次使用时，可将试剂盒所带全部的RNase A加入溶液P1后（终浓度100μg/mL）置于4℃可保存3个月左右。如果溶液P1中RNase A时间较久失活了，提取的质粒可能有微量RNA残留，在溶液P1中补加RNase A即可。
  
• 环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出，出现浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟即可恢复澄清，重新混匀，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。

• 所有的离心步骤如未加另外说明均在室温完成，使用转速可以达到8000×g（约9000rpm），带50mL转头的台式离心机。
  
• 提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10 Kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、N3的用量，洗脱缓冲液应在70℃预热。可以适当的延长吸附和洗脱的时间，以增加提取效率。
  
• 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/mL DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本试剂盒正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。
  
• 质粒DNA确切分子大小，必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。

• 第一次使用前请先在漂洗液WB瓶和去蛋白液PE瓶中按标签指示加入无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
  
• 将RNase A全部加入溶液P1中，混匀。每次使用后置于2～8℃保存。

• 取150～200mL （最多不超过300mL）过夜培养的菌液加入50mL离心管，8000×g（约9000rpm），离心1min，尽可能的倒干上清，收集菌体。
  
  • 如使用50mL离心管，可以离心弃上清后，在同一个50mL管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集到足够的菌体。
• 加7.5mL溶液P1重悬菌体沉淀，移液器吹打或者涡旋振荡至彻底悬浮。
  
  • 如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
• 加7.5mL的溶液P2，温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解，室温放置4～5min。
  
  • 温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时间不应超过5min！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠。如果很浑浊，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
• 加7.5mL溶液N3，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀此时会出现白色絮状沉淀。8000×g离心10min，小心吸取上清至新管，避免吸取到漂浮的白色沉淀。
  
  • 加入溶液N3后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀。
    
  • 如有漂浮白色沉淀，可用吸头撇开浮沫伸入液面下吸取，偶然吸到少量漂浮的白色沉淀也不影响实验结果，后续过滤漂洗过程中都会去除。
• 加入0.1体积(上清的体积的10%，约2.4mL)的内毒素清除剂到上一步所得上清，颠倒旋转混匀。
  
• 向第5步得到的上清中加入0.5倍体积异丙醇（约11mL）后充分颠倒混匀后，分多次转移混合液至吸附柱DC中，8000×g离心1min，弃滤液。
  
  • 个别情况下离心机转子倾角较大，建议每次加入吸附柱的溶液体积为10mL（不超过，以防产生漏液现象）。直到所有混合溶液通过此吸附柱。
• 加入10mL去蛋白液PE（请先检查是否已加入无水乙醇!），8000×g离心1min，弃滤液。
  
• 加入10mL漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），8000×g离心1min，弃滤液。再加入10mL漂洗液WB，重复漂洗一次，弃滤液。
  
• 将空吸附柱放回收集管中，8000×g离心3min以干燥基质膜上残留乙醇。
  
  • 该步骤为彻底去除吸附柱中残留乙醇，残留乙醇抑制下游反应并降低洗脱效率，降低质粒产量。
• 将吸附柱置于新的50mL离心管中，室温晾干2～3min，在吸附膜的中间部位加1mL～2mL洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65～75℃水浴中预热可提高产量），室温放置2min，8000×g离心1min，弃吸附柱。
  
  • 推荐：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置1min，8000×g离心1min。洗脱两遍可提高浓度约10%。
    
  • 洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是需注意体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量（最小不应少于0.8mL）。

• 接前面操作步骤5，将加入0.1体积内毒素清除剂混匀后的上清，冰浴(或放入冰箱冷冻室)5min直到浑浊变清亮透明（或仍旧稍有浑浊），中间可以充分颠倒混匀1次。
  
  • 内毒素清除剂加入上清后，可能会短暂浑浊，但是冰浴后应恢复清亮（或稍浑浊）。
• 常温放置3～5min，温度恢复室温溶液很快变为浑浊，颠倒混匀。
  
  • 如室内温度较低或想加快速度可以在37～42℃水浴，将很快变浑浊，颠倒混匀。
• 室温8000×g离心10min分相。上层水相含质粒DNA，下层蓝色油状相含内毒素和其它杂质。将含DNA的上层水相转移到新管（注意不要吸到蓝色油状层，里面含内毒素等杂质），弃油状层。
  
• 向第3步得到的上清中加入0.5倍体积异丙醇（约11mL）后充分颠倒混匀后接前面操作步骤6分多次转移混合液至吸附柱DC中，完成后续操作步骤。